流式细胞术精确诊断免疫性血小板减少症!

　　特发性血小板减少性紫癜(idiopathic thrombocytopenic purpura，ITP)是一种由于患者体内产生抗自身血小板抗体，从而导致外周血中血小板持续减少，骨髓巨核细胞数正常或增多伴有成熟障碍为特征的出血性疾病。现代研究表明是一种免疫介导的血小板减少综合征，故又称自身免疫性血小板减少性紫癜(immune thrombocytopenic purpura，ITP)。是临床最常见的一种血小板减少性疾病，约占出血性疾病总数的30%。2008年ITP国际协作组将原“idiopathic thrombocytopenic purpura”更名为“immune thrombocytopenia(免疫性血小板减少)”，缩写仍ITP。

　　免疫性血小板减少(ITP)，病情未得到有效控制者病情多凶险，易引起内脏及中枢神经系统的急性出血而危及生命。所以尽快选择采取有效治疗方案是控制病情的关键。文献报道丙球+激素的有效率在70~80%。ITP的形成机理复杂，具有B细胞免疫异常，也有T细胞的直接参与。基此，ITP的治疗应系统化个体化。目前临床治疗ITP缺乏可遵循的标准，故有必要尽快研究并推出规范化科学化的治疗方案。

　　流式细胞术(flow cytometry,FCM)是利用流式细胞仪对细胞等生物粒子的理、化及生物特性进行分析的方法。它是上个世纪70年代初开始发展，近年来随着细胞生物学、分子生物学、激光技术、电子计算机技术等学科的高度发展而研制出了性能稳定良好的流式细胞仪，并开始被应用到临床医学研究及疾病的诊断和监测。流式细胞仪具有检测速度快、测量指标多、采集数据量大、分析全面、方法灵活等特点。近年来，随着流式细胞仪性能的不断改进和测定方法与技术的快速发展，流式细胞术成为常规实验诊断的重要手段，一些检验项目已成为临床疾病诊断、治疗方案选择、预后判断等不可或缺的内容。

　　由于血液、骨髓标本采集比较方便，样品中各成分呈分散悬浮状态，易于流式细胞仪的分析、分选等，因而血液学是流式细胞术技术首先和重要的应用领域。

　　1. ITP免疫功能紊乱

　　越来越多的研究发现ITP患者外周血中存在T/B淋巴细胞亚群分布异常。吴文仪等[[1]]用流式细胞仪直接免疫法检测172例ITP患者发病期外周血淋巴细胞亚群，结果：发病期ITP患者与正常对照组比较CD3+显著降低(P<0.01)，CD8+增高(P<0.05)，CD4+/CD8+比例显著下降(P<0.01)，CD19+增高极为显著(P<0.001)。

　　1.1 CD19+CD5+/CD19+CD5- B细胞

　　CD5+B细胞可通过产生抗血小板抗体而直接作用于ITP的发病过程。Arita等[[2]] 研究显示：CD5+B淋巴细胞产生抗体的能力明显大于CD5-B淋巴细胞，且CD5+B淋巴细胞计数与自身抗体数量成正比，因此CD5+B淋巴细胞的增多可能增加了自身抗体的产生，从而导致ITP的发生。

　　高清平等[[3]]报道，CD5+CD19+细胞占CD19+细胞的百分率来表示CD5+B淋巴细胞的比例，初诊前为(19.73±1.51)%,治疗后降至(10.72±6.80)%，对照组为(10.84±1.36)%，差异有显著性(P均<0.01)。

　　1.2 Th1/Th2/Th0

　　Mouzaki等[[4]]发现急性ITP患者呈Th0优势反应，而慢性ITP患者倾向Th1优势反应，值得注意的是在处于疾病稳定缓解期或接受静脉注射免疫球蛋白治疗的患者呈现Th2优势的表现。Olsson等[[5]]使用基因芯片技术，在活动期ITP患者中发现一些T细胞基因上调，其中与Th1优势有关的IFN-γ等因子水平显著升高。这些结果表明，活动期ITP时可有Th1细胞因子活化，疾病缓解时，倾向于Th2优势模式。

　　1.3 CTL(CD8+)细胞

　　研究发现约有30%的ITP患者发病过程中始终无法检测到自身抗体的存在，另外有研究发现部分ITP患者在疾病缓解后，仍可测得自身抗体的存在。以上现象提示ITP患者可能存在其他的机制导致血小板减少。

　　随着研究的深入，对于细胞毒性T细胞以及自然杀伤细胞介导的细胞毒作用在ITP的发病过程中的作用开始引起人们的关注。可知ITP不能以简单的一元论来解释，多种因素参与其病理过程。

　　2.流式细胞仪在ITP分层治疗中的意义

　　ITP发病机制中，尽管异常克隆B淋巴细胞产生针对血小板的自身抗体是ITP发病的直接原因，但究其根源，经T、B淋巴细胞相互作用而产生自身抗体可能才是ITP真正的发病机制。

　　目前ITP的诊断缺乏特异性的实验室指标。随着新的单抗技术的扩充，流式细胞仪对T/B淋巴细胞亚群的检测越来越受到临床重视，对于ITP的分层治疗也具有一定的指导意义。

　　对于初诊病人，如CD3-CD19+(总B)和或CD19+CD5+细胞显著增多说明体内B细胞增殖，产生抗血小板抗体是血小板破坏的主要原因，此种情况Th1/Th2比例多有降低。这种情况见于大多数的初发病例，对丙球或激素普遍敏感，疗效较佳。

　　如CD4+细胞增多明显，说明免疫调节中间环节出了问题，CD4+细胞通过往下Th1/Th2分化调节机体T、B细胞免疫。可考虑CsA，CsA是CD4+细胞抑制剂，还可直接抑制B淋巴细胞活性。从CsA机理可知，它是通过Th细胞的抑制达到抑制T，B细胞的目的。

　　如CD8+细胞增多而CD3-CD19+(总B)和或CD19+CD5+不增多，说明CD8+/CTL细胞的细胞免疫作用可能是参与破坏血小板的主因素，此种常见于慢性难治性ITP患者，治疗上对大剂量IVIg或激素不敏感或无效。治疗此类型病例应首先考虑强力CD8+细胞抑制剂，可考虑ATG/ALG，但因费用昂贵大大限制了其应用。临床上可考虑的药物还有他克莫司(FK-506)，CsA等。FK-506抑制T细胞活化以及T辅助细胞依赖型B细胞的增生。CsA是CD4+细胞抑制剂，间接抑制CD8+细胞和B细胞增殖，但对CD8+细胞促进其增殖，对于ITP治疗中有所减弱它的正治疗作用。试想这是不是临床CsA疗效不确定的原因之一?

　　如检测到CD19+CD5+细胞及CD8+细胞均增多说明患者体内存在多种血小板破坏途径，治疗上呈现激素依赖或无效。治疗上应激素和环孢素等细胞抑制剂联合应用。

　　目前流式技术的不足之处在于检测结果侧重于待检细胞数量上的优势，还不能对每个细胞功能强弱作出评价及量化分析，不过抗原表位荧光强弱变化一定程度上也能说明功能的强弱。

　　3.展望

　　随着对T/B淋巴细胞亚群的进一步研究及单克隆技术的发展，有望不久将来，流式技术在阐明免疫性疾病机理及临床监测等研究领域做出更大的贡献。

　　再者，随着ITP发病机理的逐步明晰，针对CD4CD25，CD8，CD19等表位的抑制性或激动性基因工程生物制剂的研制，将是今后ITP等免疫性疾病治疗的新突破口。