流式细胞术检测血小板相关IgG的临床应用  
研究流式细胞术(FCM)检测血小板相关免疫球蛋白G(PAIgG)的特点及在特发性血小板减少性紫癜(ITP)诊断中的意义。方法：用FCM检测了47例ITP、13例非免疫性血小板减少、10例自身免疫溶血性贫血、18例其它免疫系统疾病患者以及31例健康志愿者的PAIgG，并与ELISA竞争法检测结果比较。结果：FCM 检测ITP患者PAIgG的平均荧光强度和阳性血小板百分率均明显高于正常对照组(P＜0.01)，11例有峰形异常。ITP患者FCM 检测的阳性率(87.2%)比ELISA法(83.0%)稍高，两种方法的符合率为85.1%。但两种方法都存在特异性不高的问题。结论：FCM检测PAIgG具有快速、简便和灵敏等特点，可作为免疫性血小板减少实验诊断的新方法.
特发性血小板减少性紫癜（ITP）是最常见的一种出血性疾病，主要是由于患者产生了抗血小板自身抗体而引起血小板破坏。临床上ITP尚无特异的诊断方法，主要靠排除其它血小板减少性疾病作出诊断，容易造成误诊。自1975年Dixon等〔1〕首次用定量方法检测血小板表面免疫球蛋白以来，人们已建立了各种血小板相关免疫球蛋白（PAIg）的检测方法并已成为ITP常用的一项实验诊断指标。常规ELISA仍是目前最常用的方法。流式细胞术（FCM）是一种能检测大量单个细胞的新技术，具有快速、灵敏、客观和重复性好等特点，已广泛用于血液病的基础研究和临床诊断。近10年来，国外也开始将FCM用于ITP PAIg的研究。我们使用FCM检测了ITP及其他一些疾病患者PAIgG，观察其改变的特点，并与ELISA法进行比较，以评价FCM检测PAIgG的意义。
1　资料与方法
1.1　临床资料
ITP患者47例（包括Evans综合征11例），男16例，女31例；年龄18～49岁，平均31岁。非免疫性血小板减少13例，男6例，女7例；年龄12～55岁，平均30岁。其中阵发性睡眠性血红蛋白尿症(PNH) 6例，再生障碍性贫血7例。自身免疫溶血性贫血（AIHA）患者（血小板数＞100×109/L）10例，男2例，女8例；年龄13～72岁，平均33岁。其它免疫系统疾病：系统性红斑狼疮（SLE）14例，非霍奇金淋巴瘤（NHL）3例，多发性骨髓瘤（MM）1例。以上病例的诊断符合《血液病诊断及疗效标准》（第2版）〔6〕。正常对照组为31例健康志愿者，年龄、性别与患者组匹配。
1.2　检测方法
EDTA-Na2抗凝血，离心制备富血小板血浆（PRP），用TEN（Tris-EDTA, pH7.4）洗涤3次。
FCM检测血小板表面PAIgG：按Macchi等〔5〕方法稍加改进，调整血小板浓度至100×109/L ，在测定管内加入100 μl血小板悬液和20 μl异硫氰酸荧光素（FITC）-羊抗人IgG（华美生物工程公司）稀释液；在对照管内加入100 μl血小板悬液和20 μl FITC-羊抗鼠IgG（华美生物工程公司）稀释液；在室温下避光温育30 min，洗涤2次，以PBS悬浮。在流式细胞仪（Coulter公司，Epics-XL型）上测定5 000到10 000个血小板的平均荧光强度(MFI)和阳性血小板百分率。
ELISA竞争法检测血小板表面PAIgG：用人IgG（Sigma公司）包被、封闭，调整血小板浓度至20×109/L，加入血小板悬液或人IgG标准品，立即加入HRP-羊抗人IgG稀释液（Immunotech公司），孵育，显色，测OD490值，计算。以超过正常对照组+2s判为阳性值。
1.3　统计学处理
采用SPSS统计软件包。结果以±s表示，组间比较行t检验。
2　结果
用FCM检测PAIgG，ITP患者的MFI和阳性血小板百分率均明显高于非免疫性血小板减少、AIHA 与正常对照组（表1）。如以测定值超过正常对照组的+2s定为阳性，在47例ITP患者中，33例（70.2%）表现为MFI增高，31例（66.0%）阳性血小板百分率增高。11例（23.4%）患者的细胞数对荧光强度（log值）的图中出现明显峰形异常，如峰拖尾或双峰宽峰，这种情况可与MFI和(或)阳性血小板百分率增高同时出现或单独出现，其中7例（14.9%）仅出现峰形异常而无MFI和阳性血小板百分率改变。在34例正常人中没有这种情况。将MFI、阳性荧光细胞百分率与峰形异常综合统计，FCM检测ITP患者PAIgG阳性率为87.2%，非免疫性血小板减少患者的阳性率为15.4%，AIHA患者全部阴性，但SLE等其它免疫系统疾病的阳性率为63.2%（表1）。
用ELISA法检测每个血小板结合的IgG量，结果见表1。FCM检测的阳性率比ELISA稍高，但两种方法阳性率的差别无统计学意义。有5例ITP患者FCM法PAIgG为阳性，而ELISA法为阴性；有2例ELISA法为阳性而FCM法则为阴性。两种方法符合率为85.1%。

表1　FCM及ELISA两种检测方法的PAIgG测值

组别	例数	FCM				ELISA
		PAIgG 　　阳性率(%)	MFI	阳性血小板 　　百分率(%)	PAIgG 　　阳性率(%)		fg/血小板
ITP(包括Evans综合征)	47	87.2	2.26±2.291)	44.1±29.01)		83.0		6.02±8.901)
非免疫性血小板减少	13	15.4	0.33±0.39	17.5±9.4		7.7		1.18±1.60
其它免疫系统疾病	18	63.2	0.95±1.08	33.7±21.9		47.4		4.06±3.12
AIHA	10	0	0.16±0.07	10.7±7.5		0		0.42±0.28
正常对照组	31	/	0.24±0.15	16.6±8.4		/		0.82±0.66

　　与正常对照组比较，¹⁾ P＜0.01

3　讨论
ITP的发病机制是机体免疫系统失常，产生抗血小板自身抗体使血小板过度破坏，临床上尚无特异的诊断方法。PAIg是ITP实验诊断的一项敏感指标，在各种检测方法中以ELISA应用最广〔2，3〕。近10年来，国外将FCM用于PAIgG的研究，发现FCM检测的灵敏度较高。我们用FCM检测47例ITP患者PAIgG，也发现大多数患者的MFI增高以及阳性血小板百分率增高。人们已发现ITP等免疫性血小板减少症患者外周血血小板大小和形态可有改变，大血小板可为年轻的血小板或由8倍体巨核细胞所产生，表明存在大小和形态不同的血小板群体。ITP患者FCM检测PAIgG的荧光强度（log值）图中出现峰形改变，提示存在结合了不同量IgG的血小板群体。国外资料尚未提及有关峰形的问题，但我们认为峰形异常同样具有诊断价值。
FCM检测PAIgG的阳性率大体与ELISA相同，而且两种方法符合率达85.1%。这说明FCM方法和ELISA一样，对PAIg检测具有很高的敏感性。但FCM的操作比ELISA简便、省时，需血量少，并且可随时测定单个标本，而不必像ELISA那样需等一批标本才能测定。因此，有条件的单位可用FCM代替ELISA测定PAIg。
PAIg检测的主要缺点是特异性差。FCM并不能克服这一缺点。60% SLE等免疫系统疾病的患者，FCM检测PAIg结果为阳性。这是由于这类疾病常可引起免疫性血小板减少。此外少数非免疫性血小板减少的患者也呈阳性。近年来，人们也研究了一些具有较高的特异性的方法，如血小板抗原单克隆抗体固相化法（MAIPA）、改良抗原捕获ELISA法(MACE)和血小板相关IgG特性试验（PAICA）等，这些方法应用了抗血小板膜糖蛋白的单克隆抗体，但阳性率低，方法较繁琐，难以在临床推广。有人认为，如将FCM与这些阳性率低但特异性高的方法联用，可提高PAIg检测的敏感性与特异性，从而进一步提高ITP免疫诊断的水平〕。
  

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